Induro Reverse Transcriptase와

T4 DNA Ligase 사용 시 유의사항

서론

차세대 시퀀싱(Next-Generation Sequencing, NGS) 기술이 발전하면서 Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase를 활용한 다양한 실험 프로토콜이 연구자들에게 주목받고 있습니다. 특히, Oxford Nanopore Sequencing(ONT)과 같은 기술에서 이 효소들의 활용 방법은 실험의 성공 여부를 좌우할 수 있습니다. 하지만, 두 효소를 함께 사용할 경우 몇 가지 중요한 유의사항이 존재합니다.

이 글에서는 Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase를 조합하여 사용할 때 발생할 수 있는 문제점과 해결 방법에 대해 심층적으로 다루겠습니다.

Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase의 특성

1. T4 DNA Ligase의 특징

T4 DNA Ligase는 dsDNA의 5' 인산기와 3' OH기를 연결하는 효소로, sticky ends 또는 blunt ends의 DNA 조각을 연결하는 데 필수적인 역할을 합니다. 하지만 RNA 기질에는 직접적으로 작용하지 않으며, RNA가 포함된 hybrid 구조에서는 제한적으로 작용할 가능성이 있습니다. T4 DNA Ligase의 반응을 위해서는 ATP가 필요하며, ATP는 Reverse Transcription(RT) 반응을 저해할 가능성이 있기 때문에, RT 반응을 진행한 후 T4 DNA Ligase를 적용하는 것이 일반적입니다.

2. Induro Reverse Transcriptase의 특징

Induro Reverse Transcriptase는 높은 특이성과 안정성을 가진 역전사 효소로, 특히 structured RNA나 G-quadruplexes와 같은 복잡한 구조를 가진 샘플에서 뛰어난 성능을 보입니다. Induro의 반응을 최적화하기 위해서는 Induro Reaction Buffer(B0681)를 사용하는 것이 좋지만, pH 7.5-8.5 범위 내의 Mg++ 및 단가 양이온(monovalent salt)이 포함된 단순한 버퍼에서도 활성을 유지할 수 있습니다. 따라서, 다른 버퍼 시스템을 사용할 경우에도 Induro의 성능이 유지될 가능성이 높습니다.

Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase 사용 시 고려할 점

1. 반응 순서의 중요성

Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase를 연속적으로 사용할 경우, 반응 순서를 신중하게 결정해야 합니다. 일반적으로 RT 반응 후 DNA Ligase 반응을 진행하는 것이 추천되며, 그 이유는 다음과 같습니다:

• ATP의 존재: T4 DNA Ligase 반응에 필요한 ATP는 Induro Reverse Transcriptase의 활성을 저해할 가능성이 있음
• RNA/DNA Hybrid 문제: Induro Reverse Transcriptase를 사용하면 RNA/DNA hybrid가 생성될 수 있으며, T4 DNA Ligase는 이러한 hybrid 형태의 기질을 효과적으로 연결하지 못할 수 있음

따라서, Induro Reverse Transcriptase 반응 후 cDNA를 정제한 다음 T4 DNA Ligase 반응을 진행하는 것이 가장 바람직한 방법입니다.

2. Adapter 결합 방식의 차이점

ONT Direct RNA sequencing (SQK-RNA004) 프로토콜을 기반으로 실험을 설계할 경우, Adapter 결합 방식에 따라 실험 결과가 크게 달라질 수 있습니다.

선택 1: Induro Reverse Transcriptase → T4 DNA Ligase

• cDNA 합성이 먼저 일어나고, 이후 T4 DNA Ligase를 활용하여 adapter를 결합
• 이 경우 cDNA 정제가 필요할 가능성이 높음

선택 2: T4 DNA Ligase → Induro Reverse Transcriptase

• dsDNA adapter를 먼저 결합한 후, Induro Reverse Transcriptase를 이용하여 cDNA 합성
• 이 경우 adapter가 primer 역할을 할 가능성이 있으며, random primer를 사용해야 할 수도 있음

3. G-quadruplexes와 같은 구조적 문제

G-quadruplexes는 DNA와 RNA에서 존재할 수 있는 2차 구조로, 일반적인 Reverse Transcriptase가 효과적으로 작용하기 어려운 구조 중 하나입니다. Induro Reverse Transcriptase는 G-quadruplexes와 같은 복잡한 구조에서도 상대적으로 뛰어난 활성을 보이지만, 100% 성공을 보장할 수는 없습니다. 만약 Induro로도 충분한 결과를 얻지 못한다면, 다른 RTase도 유사한 제한을 받을 가능성이 큽니다.

4. 대체 가능한 Ligase의 고려

만약 T4 DNA Ligase를 사용하기 어려운 경우, 다음과 같은 대체 효소를 고려할 수 있습니다.

T3 DNA Ligase: 일부 hybrid 구조에서도 작용 가능

RNA Ligase 2: RNA 및 hybrid 구조에 작용할 가능성이 있음

특정 실험 조건에서 T4 DNA Ligase가 최적의 선택이 아닐 수도 있으므로, 실험 목적에 맞는 Ligase를 선택하는 것이 중요합니다.

결론

Induro Reverse Transcriptase와 T4 DNA Ligase를 조합하여 사용할 때에는 반응 순서, ATP 존재 여부, RNA/DNA hybrid 문제, adapter 결합 방식, G-quadruplexes 등의 구조적 문제를 신중하게 고려해야 합니다. 특히, ONT Direct RNA sequencing 프로토콜을 사용할 경우, 실험 설계 단계에서 이러한 문제들을 사전에 검토하여야 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다. 만약 실험 과정에서 문제가 발생한다면, **cDNA 정제를 추가하거나, 다른 Ligase를 고려하는 등의 대안을 검토하는 것이 중요📄합니다. 🎯🔄 실험 설계를 위해 위 내용을 참고하시고, 성공적인 결과를 얻으시길 바랍니다!