극소량 DNA의 라이브러리 수율 향상 방법 및 실험 팁

극소량 DNA의 라이브러리 수율 향상 방법 및 실험 팁

극소량 DNA의 라이브러리 수율 향상 방법 및 실험 팁

DNA 라이브러리 제작 과정에서 극소량의 DNA를 사용해야 하는 경우, 성공적인 결과를 얻기 위해 여러 가지 중요한 사항을 고려해야 합니다. 특히, oocyte(난자)나 embryo(배아)와 같은 검체로부터 DNA를 추출할 때, 검체의 특성과 DNA의 상태를 파악하는 것이 핵심입니다.

1. 극소량 DNA 샘플의 특징과 전처리 방법

제가 oocyte나 embryo를 직접 사용해본 경험은 없지만, 일반적으로 DNA의 integrity(완전성)와 purity(순도)가 좋다면 라이브러리 키트를 사용하는 데 문제가 없을 것입니다. 그러나 FFPE 샘플이나 purity가 좋지 않은 경우에는 DNA repair 또는 Cleanup kit를 사용하여 전처리하는 것이 좋습니다. 세포에서 얻은 DNA라면 별다른 문제는 발생하지 않을 것입니다.

2. DNA Input 및 라이브러리 Copy 수 계산

DNA input에서 얼마나 많은 genome copy가 포함되어 있는지 파악하는 것이 중요합니다. 라이브러리에 포함된 copy 수를 대략적으로 계산해 볼 수 있으며, 이 정보는 실험 설계에 매우 유용합니다.

계산 예시 (Human gDNA, 1n 기준):

  • 인간 게놈 크기: 3.3 × 109 bp (1n)
  • 1 bp의 평균 분자량: 650 Da (g/mol)
  • 아보가드로 수: 6.022 × 1023 분자/mol

1. 게놈의 총 분자량: 3.3 × 109 × 650 = 2.145 × 1012 g/mol
2. 게놈의 질량: 2.145 × 1012 / (6.022 × 1023) = 약 3.56 × 10-12 g
3. 유전체 개수 계산: 100pg의 인간 gDNA (1n)에는 약 28.07개의 게놈이 포함됩니다.

따라서, 28 depth 정도만 달성할 수 있으며, 30 depth를 목표로 한다면 부족할 수 있습니다. 이 계산 결과를 통해 100pg의 gDNA는 methyl-seq에 적합하지 않다는 결론을 내릴 수 있습니다. 만약 성공적인 EM-seq을 원한다면, 사람보다 유전체 크기가 작은 생물종을 사용하거나 최소 200-300개의 oocyte를 사용하는 것이 좋습니다.

3. 실험 과정에서의 Loss 최소화 방법

  • Adaptor 결합 과정: Ligation of EM-seq Adaptor 단계에서 권장되는 20도에서 15분 인큐베이션 대신, 라이브러리 수율을 극대화하거나 다양성을 높이고자 한다면 최소 2시간 또는 Overnight 인큐베이션을 고려하세요.
  • Washing 과정: Cleanup 단계에서 80% ethanol로 30초씩 두 번 세척합니다. 이때 비드를 씻어낸다는 느낌보다는 튜브를 씻어낸다는 느낌으로 ethanol을 넣고, 3초 정도 지난 후 즉시 제거합니다. 동일한 방법으로 두 번 반복합니다.
  • 건조 단계: 비드를 건조할 때는 손의 열로 건조시키며, 비드의 반짝임이 사라지는 순간에 다음 시약을 추가합니다.
  • 일루션: Ethanol이 남아 있으면 Tapestation 측정 시 Broad peak가 발생할 수 있습니다. 좀 더 농축된 형태로 일루션을 원한다면 20ul 대신 더 적은 volume으로 추출하십시오.
  • Amplification: 극소량 DNA input의 경우 최대 14 cycle까지 증폭이 가능합니다. 그러나 충분한 라이브러리가 만들어졌다면 PCR 사이클 수는 최소화하는 것이 좋습니다.

4. 실험 설계 및 샘플 활용

극소량 DNA라 하더라도 DNA copy 수가 충분하다면 DNA 라이브러리 정량에서 정확히 측정되지 않더라도 NGS 진행을 시도해 볼 수 있습니다. 이론적으로 극소량의 DNA라도 충분한 copy 수를 확보하면 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다.

이 내용은 이론적인 접근이 포함되어 있으므로, 실제 실험 결과와 다를 수 있습니다. 하지만 실험 설계 시 참고하시면 도움이 될 것입니다.

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